LeonCaly, Julian D.Druce, Mike G.Catton, David A.Jans, Kylie M.Wagstaff

1. Victorian Infectious Diseases Reference Laboratory, Royal Melbourne Hospital, At the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, Victoria, 3000, Australia
2. Biomedicine Discovery Institute, Monash University, Clayton, Vic, 3800, Australia

Нийтлэгдсэн огноо: 2020.04.03

Нийтлэгдсэн сэтгүүл: Antiviral Research

Холбоос: https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2020.104787

Тодруулах хэсэг:

• Ivermectinнь in vitro орчинд COVID-19 үүсгэгч вирүсийн (SARS-CoV-2) репликацийг дарангуйлж байна.
• Нэг удаагийн эмчилгээний тун нь эсийн өсгөвөр дэх вирүсийг 48 цагийн дотор 5000 дахин бууруулах боломжтой.
• Ivermectinнь АНУ-ын Хүнс, эм бэлдмэлийн хяналт удирдлагын газраас (FDA) шимэгчийн халдварын эмчилгээ хэмээн зөвшөөрөгдсөн. Тиймээс өөр өвчнийг эмчлэх зорилгоор хэрэглэх боломжтой гэж үзэж байна.
• ДЭМБ-ын зайлшгүй шаардлагатай эмийн жагсаалтад Ivermectinбагтсан ба энэхүү эмийн хангамж болон олдоц дэлхийн улс орнуудад хангалттай байдаг.

Хураангуй

COVID-19 өвчний боломжит эмчилгээг тогтоохын тулд хэд хэдэн эмнэлзүйн туршилтыг хийж байгаа боловч дэлхий нийтээр энэхүү дэгдэлтийн эсрэг авч арга хэмжээ нь зөвхөн хяналт шинжилгээ болон барьж тогтоох бодлогоор хязгаарлагдаж байна. АНУ-ын Хүнс, эм бэлдмэлийн хяналт удирдлагын газраас (FDA) Ivermectin эмчилгээг шимэгчийн эсрэг өргөн хүрээний үйлчилгээтэй гэж зөвшөөрсөн байдаг ба in vitro орчинд COVID-19 өвчний вирүсийн (SARS-CoV-2) репликацийг дарангуйлдаг хэмээн бид үзэж байна. SARS-CoV-2 вирүсээр Vero-hSLAM эсүүдийг халдварлуулж ivermectin эмчилгээг хийхэд 2 цагийн дараа үйлчлэл үзүүлж байсан. Харин 48 цагийн дараа вирүсийн РНХ-ийн репликацийг ойролцоогоор 5000 дахин бууруулж байв. Бид болон бусад судалгааны багийнхан Ivermectin нь вирүсийн эсрэг өргөний хүрээний үйлчилгээтэй болохыг in vitro орчинд тогтоогоод байна. α/β1 гетеродимерийг интаграцийн болон импортын уураг хоорондын харилцан үйлчлэлийг болон IN бөөмийн зөөвөрлөлтийг дарангуйлагч гэж тодорхойлсон. Энэхүү механизмийг анх хүний дархлал хомсдолын вирус-1 (ХДХВ-1)-ийн судалгаан дээр олж тогтоосон. Ivermectin эмчилгээ нь дээр дурьдсан эсийн бөөмийн зөөвөрлөлт болон ХДХВ-1-ийн халдварыг дарангуйлдаг болохыг баталсан.

Ivermectin нь мөн вирүсийн уургууд болон эзэн биеийн эсийн бөөмийн зөөвөрлөлтийг, тухайлбал simian вирүсийн SV40 том хавдрын антиген (T-ag) болон Dengue вирүсийн (DENV) бүтцийн бус уураг-5-ын зөөвөрлөлтийг дарангуйлдаг. DENV 1-4, Баруун Нилийн вирүс, Венесуэлийн адууны вирүст энцефалит (VEEV), томуу зэрэг РНХ вирүсээр халдварлах эрсдлийг дээр дурьдсан ivermectin эмийн үйлчлэл нь хязгаарладаг болохыг харуулж байна.

Ivermectin нь ДНХ агуулсан вирүсийн тодруулбал галзуу өвчний хуурамч вирүсийн эсрэг (PRV) үр дүнтэй эмчилгээ болох нь in vitro болон in vivo орчинд аль алинд нь батлагдсан бөгөөд ivermectin эмийн эмчилгээ нь PRV-ийн халдвартай хулгануудын амьдрах хугацааг нэмэгдүүлж байгааг судалгаагаар баталсан байна. Хулганад хийсэн судалгаагаар Зика вирүсийн (ZIKV) эсрэг ivermectin эмийн үр нөлөө ажиглагдаагүй боловч цаашдын судалгаануудад ZIKV вирүсийн эсрэг ivermectin эмийн механизмыг дахин үнэлэх боломжтой гэж үзжээ.

2014-2017 оны хооронд Тайланд улсад хийсэн DENV халдварын эсрэг III фаз эмнэлзүйн судалгаагаар, ivermectin эмийг өдөрт нэг удаа амаар ууж хэрэглэхэд ийлдсэн дэх вирүсийн NS1 уургийг мэдэгдэхүйц бууруулж байжээ. Гэвч цусан дах вирүсийн хэмжээ болон эмнэлзүйд ямар нэгэн өөрчлөлт илрээгүй аж. Дэлхий нийтэд цар тахал үүсгээд буй COVID-19 өвчний шалтгаан болох SARS-CoV-2 вирүс нь амьсгалын замын цочмог хам шинжтэй коронавирүстэй (SARS-CoV) маш төстэй бөгөөд РНХ-ийн дан утаслаг агуулсан вирүс юм. SARS-Co нуклеокапсидын уургийн дохиололоос хамааралтай нуклеоцитоплазмын хаалтанд халдварын үед IMPα/β1 хэрхэн нөлөөлдөг болохыг SARS-CoV уургууд дээр судалсан ба энэ нь эсийн хуваагдалд нөлөөлдөг байж болзошгүй юм.

Нэмж дурдахад, SARS-CoV дагалдах уураг ORF6 нь барзгар эндотелийн торлог/гольджийн мембран руу IMPα/β1-ийг нэвтрэхийг хориглох замаар STAT1 транскрипцийн хүчин зүйлийн эсрэг, вирүсийн эсрэг үйлчилгээтэй болохыг тогтоосон.

 Дээрх мэдээллүүдийг нэгтгэн дүгнэвэл, ivermectin эмийн бөөмийн дамжуулалтыг дарангуйлах үйл ажиллагаа нь SARS-CoV-2 вирүсийн эсрэг үр нөлөөтэй байж болзошгүй хэмээн үзэж байна.  Ivermectin эмийн вирүсийн эсрэг үйл ажиллагааг нотлохын тулд, Vero/hSLAM эсүүдийг SARS-CoV-2 вирүсийн Australia/VIC01/2020 геномийн 0.1 тунгаар 2 цагийн турш халдварлуулсаны дараа 5 μM тун ivermectin эмийн нэмж өгсөн. 0-3 өдрийн дотор супернатант (идэвхигүй вирионууд) дээж болон эсийн товгорууд үүссэн ба SARS-CoV-2 вирүсийн РНХ-ийн репликацийг RT-PCR-ийн аргаар гарган авсан (Зур. 1A/B). Ivermectin эмийн эмчилгээг хийхэд, 24 цагийн дотор супернатант дээжин дэх вирүсийн РНХ-ийн репликаци 93%-иар буурсан. Үүнтэй адил ivermectin эмийн эмчилгээнд эс холбоот вирүсийн РНХ-ийн (ангижраагүй буюу задраагүй) 99.8% нь буурсан байдал ажиглагдсан.

Хяналтын дээжтэй харьцуулахад, 48 цагийн дотор ivermectin эмээр эмчилсэн вирүсийн РНХ-ийн тоо ойролцоогоор 5000 дахин буурсан нь ivermectin нь вирүсийн бүх материалыг 48 цагийн дотор устгах боломжтой гэдгийг харуулж байна. Харин вирүсийн РНХ-ийн бууралт 72 цагийн дотор дахин ажиглагдаагүй болно. Мөн бидний өмнө судалж байсанчлан, энэхүү судалгааны явцад ivermectin эмийн ямар нэгэн хоруу чанар илрээгүй болно.

Зураг 1. Ivermection эмчилгээ нь SARS-CoV-2 вирүсийн хүчтэй дарангуйлагч

Ivermectin эмийн үр нөлөөг цаашид тодорхойлохын тулд, SARS-CoV-2 вирүсээр халдварлагдсан эсийг халдварын дараах 2 цагийн дотор ivermectin эмийн цуврал уусмалаар эмчилсэн (Зур. 1C/D).

Дээр дурдсанчлан, 5 μM ivermectin эмийн тунгаар эмчилсэн супернатант болон эсийн товгороос авсан дээжинд хоёуланд нь 48 цагийн дотор вирүсийн РНХ-ийн бууралт ойролцоогоор 5000 орчим байсан.

Дахин хэлэхэд, ivermectin эмийн туршиж үзсэн аль ч тунд хоруу чанар ажиглагдаагүй болно. Ivermectin эмийн хамгийн их хагас задралын концентраци буюу IC50-ийг ∼2μM байхаар тогтоов. Уг шинжилгээ нь үнэхээр SARS-CoV-2 вирүсийг илрүүлсэн болохыг нотлохын тулд RT-PCR-ийн туршилтуудыг E ген дээр бус, генийн өвөрмөц праймер ашиглан RdRp ген (Зур. 1E/F) дээр давтан хийсэн ба супернатант болон эс холбоот вирүсийн аль алинд нь ойролцоо үр дүн ажиглагдаж байсан.

Эдгээр үр дүнг нэгтгэн үзвэл, ivermectin эмчилгээ нь in vitro орчинд SARS-CoV-2 вирүсийн эсрэг үйлчилгээ үзүүлсэн ба 24-48 цагийн дотор эхний тунгийн үр дүнг хянах боломжтой юм. Бусад вирүсийн халдварын үед ivermectin-ийг хэрэглэхэд вирүсийн уургийг зөөвөрлөгч IMPα/β1-ийг дарангуйлах замаар вирүсийн эсрэг үйлчлэл үзүүлдэг ба энэ механизмыг SARS-CoV-2 вирүсийн хувьд батлахын тулд лабораторид дараа дараагийн судалгааг хийх шаардлагатай  байна.

Эцэст нь хэлэхэд, SARS-CoV-2 вирүсийн эсрэг үр дүнтэй эмчилгээг боловсруулж, халдварын эхэн үед өвчтөнд өгвөл вирүсийн репликацийг бууруулах, өвчний хүнд явцаас урьдчилан сэргийлэх, хүнээс хүнд халдвар дамжих явцыг хязгаарлах боломжтой юм. Мөн SARS-CoV-2 вирүсийг ivermectin-ээс бусад аргаар эмчлэх жишиг судалгаа хийх нь нэн чухал ач холбогдолтой байна.

Энэхүү товч мэдээлэл нь SARS-CoV-2 вирүсийн эсрэг боломжит эмчилгээ нь ivermectin байж болох талаар дурьдсан өмнөх судалгаануудтай ижил төстэй билээ. Эдгээр өөр хоорондоо төстэй судалгаануудын аль нэг нь батлагдах хүртэл боломжит бүх туршилтыг хурдан шуурхай хийх шаардлагатай байна.

Ivermectin нь АНУ-ын Хүнс, эм бэлдмэлийн хяналт удирдлагын газраас (FDA) зөвшөөрөгдсөн хүний биед хэрэглэхэд аюулгүй, шимэгчээр үүссэн халдварын эсрэг эмийн эмчилгээ юм. Саяхан хийсэн хяналт болон мета-анализаар ivermectin эмийн өндөр тун нь стандарт бага тунт эмчилгээний үр дүнтэй харьцуулахад харьцангуй аюулгүй хэмээн үзсэн ч, жирэмсэн үед аюулгүй байдлын талаархи дүгнэлт хийхэд хангалттай баримт байхгүй байна.

COVID-19 өвчтөнд үзүүлэх энэхүү эмийн ашиг тусыг цаашид үнэлэх чухал алхам бол ivermectin эмчилгээний тунг тохируулах юм. Судлаачид фармакокинетик өгөгдөл дээр үндэслэсэн тохиромжит тунг тогтоох горим боловсруулж болно гэж тэмдэглэжээ. Өмнө нь дурьдсанчлан, Тайланд улсад хийгдсэн DENV эсрэг ivermectin эмчилгээний судалгаагаар эмнэлзүйд үр дүн илрээгүй, мөн DENV нь SARS-CoV-2 вирүсээс эрс ялгаатай боловч энэхүү судалгааны загвар нь цаашдын ажлыг урагшлуулахад чухал ач холбогдолтой гэж үзэж байна. Дээрх бүх баримтууд дээр үндэслэн дүгнэхэд ivermectin эмийн эмчилгээг SARS-CoV-2 вирүсийн эсрэг эмчилгээ гэж үзэх нь зүйтэй юм.

Арга, аргачлал:

Эсийн өсгөвөр, вирүсийн халдвар болон эмийн эмчилгээ

Vero/hSLAM эсүүдийг нь 37 0С, 5% СО2 орчинд Earle’s Minimum Essential Medium (EMEM)-д хадгалж байсан. EMEM нь 7% үхрийн ургийн ийлдэс (FBS) (Bovogen Biologs, Keilor East, AUS) 2 mM L-Глутамин, 1mM натрийн пируват, 1500 мг/л натрийн бикарбонат, 15mM HEPES болон 0.4 мг/мл генетиныг агуулдаг орчин юм. 
Эсүүдийг 12 ширхэг бэлдэцэнд суулган өсгөвөрлөж 0.1 тун, 2%-ийн үхрийн ургийн ийлдэс (FBS) агуулсан орчноор 2 цагийн турш халдварлуулсан. Инокулум агуулсан орчныг арилган оронд нь 1мл зөвхөн Ivermectin агуулсан шинэ орчныг (2% FBS) эсэд оруулан заасан концентрацид эсвэл Dimethyl sulfoxide (DMSO)-д дангаар нь 0-3 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн. Тохиромжтой цагт эсийн өсгөвөрийн шингэнийг цуглуулж, хаягдлыг арилгахын тулд 6000g-д 10 минутын турш эргүүлэн, дээд шингэн (супернатант)-ийг шинэ цуглуулах хоолойд ялган хийсэн. Эсийн дан давхаргыг хусах аргаар цуглуулан 1мл шинэ орчинд (2% FBS) дахин уусгасан. Туршилтын хугацаанд хордуулах чанарын хяналтыг халдваргүй эрүүл эсүүд дээр зэрэгцүүлэн хийсэн болно.

SARS-CoV-2 сDNA үүсгэх

РНХ-ийг QIAamp 96 Virus QIAcube HT иж бүрдэл (Qiagen, Hilden, Germany)  ашиглан 200 μL хэмжээтэй дээжийн супернатант буюу эсийн суспензээс гаргаж авсан ба 60μl-т угаасан болно. Урвуу транскрипцийг BioLine SensiFAST cDNA иж бүрдэл ашиглан хийсэн (Bioline, London, United Kingdom) ба нийт урвалын холимог 20 μl байв. Энэхүү нийт урвалын холимог нь 10 μL РНХ-ийн ханд, 4 μl хэмжээтэй 5x TransAmp буффер, 1μl урвуу транскриптаза, болон 5 μl нуклеазийн чөлөөт усыг агуулдаг. Урвалыг 25 хэмд 10 минутын турш, 42 хэмд 15 минут, 85 хэмд 5 минутын турш тус тус явуулж эсийг өсгөвөрлөн авсан.

TaqMan RT-PCR шинжилгээг ашиглан SARS-CoV-2 вирүсийг илрүүлэх

TaqMan RT-PCR шинжилгээг 2.5 μl cDNA, 10 μl праймер загвар (Precison PLUS qPCR Master Mix) ашиглан хийсэн. Precison PLUS qPCR Master Mix загвар нь 1 μM Forward (5’- AAA TTC TAT GGT GGT TGG CAC AAC ATG TT-3’), 1 μM Reverse (5’- TAG GCA TAG CTC TRT CAC AYT T-3’) праймерууд болон 0.2 μM probe (5’-FAM- TGG GTT GGG ATT ATC-MGBNFQ-3’) BetaCoV рүү чиглэсэн RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) ген эсвэл Forward (5’-ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT -3’), 1 μM Reverse (5’-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A-3’) праймерууд болон 0.2 μM probe (5’-FAM-ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG-286 NFQ-3’) BetaCoV рүү чиглэсэн E-ген гэсэн бүтцээс тогтдог.

RT-PCR шинжилгээ нь ABI 7500 Fast real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) төхөөрөмж дээр 95°C хэмд 2 минут, 95°C хэмд 5 секунд, 60°C хэмд 24 секундийн горим дээр тус тус хийгдсэн. SARS-CoV-2 cDNA (Ct∼28)-ийг эерэг хяналт болгон ашигласан.

Тооцоолсон Ct утгыг fold-reduction тооцоолол ашиглан хөрвүүлсэн ба ΔCt (РНХ-ийн өөрчлөлт 2ˆΔCt-тай тэнцүү байсан) аргыг хэрэглэн хяналтын бүлэгтэй эмчлэгдсэн дээжийг харьцуулсан. Мөн DMSO-ийн дан дээжийг хувиар (%) илэрхийлсэн. IC50 буюу хагас хамгийн их дарангуйлах концентрацийн утгыг 3 параметр болгон тунгийн хариу урвалын муруйг GraphPad prism дээр хийлээ.

Эх сурвалж :  https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166354220302011

Орчуулсан: Б.Өлзийсайхан, ЭША, АУХ

Хянасан: Л.Тулгаа (Ph.D), ЭНБД, АУХ