Ө.Хулан1,2, Т.Хулан1, Т.Балжинням2, Э.Баасансүрэн1, С.Цогтсайхан1, Л.Энхсайхан1, Б.Байгалмаа3, Н.Цэвэлмаа3, Б.Галиндэв3, Л.Содномцогт3, Б.Мөнхбат3, Н.Мөнхтүвшин2, Ц.Билэгтсайхан2,3

1Бичил амь-Дархлаа Судлалын Тэнхим, БиоАнагаахын Сургууль, АШУҮИС

2Эрдэм Шинжилгээний Төв Лаборатори, АУХ

3Цөм Лаборатори, Шинжлэх Ухаан Технологийн Газар, АШУҮИС

khulan.ims@st.mnums.edu.mn

Утас:80018631, 99228631

Хураангуй: Интерферон гамма (IFN-γ) нь CD4+ Th1, NK эс, CD8+ T эсээс ялгарч хавдрын хяналт, үрэвслийн урвалыг нэмэгдүүлэх, дархлааны эффектор эсийг идэвхжүүлэх замаар оролцоно.1 Нөгөө талаас TLR (Toll like receptor) нь гадны эмгэгтөрөгчийг таньж холбогдсоноор I хэв шинжийн интерферон болон үрэвслийн урьдал цитокинийг ялгаруулж дархлааны урвалыг өрнүүлдэг.2 TLR-ийн нэг гишүүн нь TLR5 бөгөөд үүний өвөрмөц лиганд нь грам сөрөг бактерийн шилбүүрийн бүтцийг бүрдүүлэгч флагеллин юм. Бактерийн флагеллин нь интерферон гаммагийн дохио дамжилтанд хэрхэн нөлөөлдөг болох нь одоогоор тодорхойгүй байна. Судалгаанд хулганы аортын шугаман эндотел эсийн (END-D) өсгөвөрийг ашигласан. TLR5-ийн лиганд флагеллиний эсийн амьдрах чадварыг MTT болон CCK8 аргаар үнэлсэн. Эсийн дээд шингэн дэхь азотын дан ислийн (NO, Nitric oxide) концентрацийг Грейсийн урвалж ашиглан тодорхойлсон. TLR5-ийн лигандийн 20 мкг/мл хүртэлх тун нь END-D эсийн амьдрах чадварт нөлөөлөхгүй байсан ба интерферон гаммагаар өдөөгдөх азотын дан ислийн гарцыг TLR5-ийн лиганд флагеллин нь тун хамааралтайгаар ихэсгэж байсан.

Түлхүүр үг: TLR5, IFN-γ, флагеллин, азотын дан исэл, END-D

Үндэслэл:  TLR5 нь дархлааны болон дархлааны бус эсийн аль алинд нь экпресслэгддэг. Мөн хүний болон хулганы уушигны эдэд, эпитель, лимфоцит, макрофаг, нейрофил болон цулцангын макрофаг эсэд өндөр экспресслэгддэг байна. Сүүлийн үед IFN-γ болон TLR-ийн харилцан үйлчлэлийг судалсан ажлууд ихээхэн анхаарал татаж байна. TLR нь хэд хэдэн механизмаар IFN-γ-ийн идэвхжил, дохио дамжилтыг өдөөдөг. TLR-ийн нэг болох TLR5 нь эсийн плазмын мембранд нийлэгшиж, эсийн гаднах PAMPs (Pathogen-associated molecular pattern)-ийг таньж холбогддог. TLR5 нь эсийн мембран болон эндосомд байрлах бөгөөд грам сөрөг бактерийн шилбүүрийн филаментийг бүрдүүлэгч флагеллинийг таньж холбогддог юм. Бактерийн флагеллин нь интерферон гаммагийн дохио дамжилтанд хэрхэн нөлөөлдөг болох нь одоогоор тодорхойгүй байгаа нь энэхүү судалгааны ажлын үндэслэл боллоо.

Зорилго: Интерферон гаммагийн дохио дамжилтанд TLR5-ийн лигандийн нөлөөг тодорхойлох

Материал, аргазүй: Судалгаанд хулганы аортын шугаман эндотел (END-D) эсийг идэвхгүйжүүлсэн 10%-н үхрийн хээлийн ийлдэс (FCS), антибиотикийн холимог (penicillin G, streptomycin, amphotericin B) агуулсан эсийн орчинд (DMEM medium) орчинд 5% СО2-той, чийгшилтэй, 37˚С хэмд өсгөвөрлөн ашигласан. Эндотел эсэд TLR5-ийн лиганд флагеллиний эс хордуулах тунг MTТ болон CCK8 шинжилгээгээр тодорхойлсон. Эсийн дээд шингэн дэх азотын дан ислийн (NO, nitric oxide) концентрацийг Гриессийн урвалж ашиглан тодорхойлсон. Туршилтыг хамгийн багадаа 3 удаа давтсан. Төлөөлүүлэх туршилтын үр дүнг үзүүлэв. P<0.05 үед статистикийн ач холбогдол бүхий ялгаатай гэж үнэлсэн.

Үр дүн: Эсийн амьдрах чадвар тодорхойлох MTТ болон CCK8 шинжилгээгээр TLR5-ийн лигандын 10 нг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл тунгууд эндотел эсийн амьдрах чадварт нөлөөлөхгүй байсан (Зураг 1). Тайван байдалд байгаа эндотел эс азотын дан ислийг ялгаруулдаггүй. Харин интерферон гамма дангаараа азотын дан ислийн гарцыг ихэсгэдэг бол TLR5-ийн лиганд нь тун хамааралтайгаар азотын дан ислийн гарцыг нэмэгдүүлж байсан (Зураг 2). Интерферон гаммагаар өдөөгдөх азотын дан ислийн гарцад pre (-1) болон post (+3) өдөөлт нь TLR5-ийн лигандаар үйлчлэх хамгийн тохиромжтой хугацаа байлаа (Зураг 3).

Зураг 1. TLR5-ийн лигандийн эс  хордуулах тунг тодорхойлсон дүн MTT аргаар тодорхойлсон дүн (24 цаг)

Тайлбар: TLR5-ийн лигандийн 0.01 мкг/мл, 0.1 мкг/мл, 1.0 мкг/мл,10 мкг/мл тунгаар 24 цаг эндотел эсэд тунг үйлчилсний дараа эсийн амьдрах чадвар тодорхойлох шинжилгээ хийсэн. Босоо тэнхлэгийн дагуу МТТ-ийн идэвхжлийг, хэвтээ тэнхлэгийн дагуу TLR5-ийн лигандийн тунгг тус тус харуулав. Туршилтыг хамгийн багадаа 3 удаа давтсан. Төлөөлүүлэх туршилтын үр дүнг үзүүлэв.

Зураг 2. Интерферон гаммагаар өдөөгдсөн азотын дан ислийн гарцад TLR5-ийн лигандийн  нөлөөг тодорхойлсон дүн

Тайлбар: Эндотел эсэд TLR5-ийн лигандийн  1.0 мкг/мл тунгаар 1 цагийн турш үйлчилсэн. Үүний дараа 100 нг/мл IFN-γ-аар 36 цагийн турш үйлчилж азотын дан ислийн гарцыг үнэлсэн. Босоо тэнхлэгийн дагуу азотын дан ислийн гарцыг, хэвтээ тэнхлэгийн дагуу TLR5-ийн лигандийн  тунг тус тус харуулав. p<0.05 утгыг статистикийн үнэн магадлалтай ялгаатай гэж тооцсон.

Зураг 3. Интерферон гаммагаар өдөөгдөх азотын дан ислийн гарцад TLR5-ийн лигандаар үйлчлэх тохиромжтой хугацааг тодорхойлсон дүн

Тайлбар: TLR5-ийн лигандийн 1.0 мкг/мл тунгаар -3-аас +3 цагийн хооронд үйлчилж, 100 нг/мл IFN-γ-аар 24 цагийн турш үйлчилсэн. Босоо тэнхлэгийн дагуу азотын дан ислийн концентрацийг хэвтээ тэнхлэгийн дагуу IFN-γ-ийн үйлчилсэн хугацааг тус тус үзүүлэв. p<0.05 утгыг статистикийн үнэн магадлалтай ялгаатай гэж тооцсон.

Дүгнэлт:

1. TLR5-ийн лигандийн 10 мкг/мл хүртэлх тун нь END-D эсэд хоргүй буюу эсийн амьдрах чадварт нөлөөлөхгүй байна.
2. Эндотел эсэд интерферон гаммагаар өдөөгдсөн азотын дан ислийн гарц нь TLR5-ийн лиганд флагеллиний нөлөөгөөр нэмэгдэж байна.

Хэлцэмж:

Бид энэхүү судалгаагаар төрөлхийн дархлаа тогтолцооны үндсэн рецепторын нэг болох TLR5 нь интерферон гаммагийн дохио дамжилтанд хэрхэн нөлөөлж буйг урвалын эцсийн бүтээгдэхүүн болох азотын дан исэлийн түвшинд авч судаллаа. Бидний энэ судалгаа нь шугаман эсийн өсгөвөр ашиглан төрөлхийн болон өвөрмөц дархлааны хариу урвалын загварыг лабораторийн нөхцөлд үүсгэж байгаа нь онцлог бөгөөд цаашид вирусийн болон бактерийн эсрэг эмчилгээний шинэ технологи боловсруулахад онолын үндэслэл болох боломжтой. TLR5 нь флагеллинийг таньж холбогдсоноор төрөлхийн дархлаа тогтолцоог идэвхжүүлж өгдөг. Иймээс TLR5-ийн дохио дамжилтыг судлах нь олон талын ач холбогдолтой юм. Sugiyama нар (2003)-ын судалгаанд хулганы аортын эндотел (END-D) эс болон макрофаг төст RAW264.7 эс дэх азотын дан ислийн ялгарах механизмийн ялгааг судалсан судалгааны үр дүн бидний судалгааны үр дүнтэй харьцуулж болохуйц байна. Энэхүү судалгаанд хулганы рекомбинат интерферон гамма, Escherichia coli O55:B5-аас гаргаж авсан LPS мөн хулганы макрофаг төст RAW264.7 эс болон END-D эс ашигласан байна. Энэхүү судалгаанд END-D эсийг LPS (1 мкг/мл)-ээр үйлчилж IFN-α (100 U/мл), IFN-γ (20 нг/мл), IL-1α (100 нг/мл), IL-12 (50 U/мл)-оор нэмж үйлчилсэн байна. Судалгааны үр дүнгээс харахад интерферон гаммагаас бусад цитокин (IFN-α, IL-1α, IL-12)-ууд азотын ислийг ялгаруулахгүй байсан ба интерферон гамма LPS-ын хамт азотын дан ислийн ялгаралтыг 1.5-2 дахин ихэсгэсэн үр дүн гарсан байна. Morikawa нарын (2011)-ын судалгаанд интерферон гаммаг дангаар нь болон липополисахаридын (LPS)-ийг хамт нэмснээр азотын дан ислийн гарцыг нэмэгдүүлж байсан ба энэхүү үр дүн нь манай судалгааны үр дүнтэй дүйж байлаа.6,7 

Ном зүй 

1. Miao EA, Andersen-Nissen E, Warren SE, Aderem A. TLR5 and Ipaf: dual sensors of bacterial flagellin in the innate immune system. Seminars in immunopathology. Sep 2007;29(3):275-288.
2. Smith KD, Andersen-Nissen E, Hayashi F, et al. Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for protofilament formation and bacterial motility. Nature immunology. Dec 2003;4(12):1247-1253.
3. Blouin CM, Hamon Y, Gonnord P, et al. Glycosylation-Dependent IFN-gammaR Partitioning in Lipid and Actin Nanodomains Is Critical for JAK Activation. Cell. Aug 11 2016;166(4):920-934.
4. Hu X, Ivashkiv LB. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. Oct 16 2009;31(4):539-550.
5. Tsolmongyn B, Koide N, Jambalganiin U, et al. A Toll-like receptor 2 ligand, Pam3CSK4, augments interferon-gamma-induced nitric oxide production via a physical association between MyD88 and interferon-gamma receptor in vascular endothelial cells. Immunology. Nov 2013;140(3):352-361.
6. Gao D, Li W. Structures and recognition modes of toll-like receptors. Proteins. Jan 2017;85(1):3-9.
7. Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. Immunity. May 27 2011;34(5):637-650.
8. Hajam IA, Dar PA, Shahnawaz I, Jaume JC, Lee JH. Bacterial flagellin-a potent immunomodulatory agent. Experimental & molecular medicine. Sep 1 2017;49(9):e373.
9. Stanislawowski M, Wierzbicki PM, Golab A, et al. Decreased Toll-like receptor-5 (TLR-5) expression in the mucosa of ulcerative colitis patients. Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society. Oct 2009;60 Suppl 4:71-75.